Identifizierung und Charakterisierung des HSP70 Makronukleus-Gens aus Euplotes crassus

Inhaltsangabe:Zusammenfassung: Bei dem hypotrichen Ciliaten E.crassus wurde das Makronukleus-Chromosom welches das HSP7O-Gen trägt identifiziert. Für die Identifikation eines internen Gen-Fragmentes wurde die Methode der heterologen PCR angewendet. Die 5'- und 3'-Enden des Gens konnten mit einem telomerspezifischen Primer und mit homologen Primern die aus dem internen PCR-Fragment abgeleitet wurden amplifiziert werden. Nach Sequenzierung der PCR-Fragmente und einem Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit Aminosäuresequenzen aus weiteren Organismen wurde eine Homologie von bis zu 95 % festgestellt. Untersuchungen zur Kopienzahl zeigten daß im Makronukleus das HSP7O-Gen in einer Kopienzahl von 2000-2500 Kopien vorlag. Dies entsprach der durchschnittlichen Kopienzaht von E.crassus. Um Promotor-Elemente zu identifizieren wurde der Transkriptionsstartpunkt bestimmt. Eine Analyse der 5'-nicht kodierten Region zeigte daß keine Sequenzhomologie zu den bekannten core-Promotor-Elementen TATA-Box und Initiator-Element bestand. Durch Sequenzvergleiche mit der bekannten Konsensussequenz der Hitze-Schock-Elemente wurden jedoch zwei Hitze-Schock-Elemente identifiziert. Weitere Untersuchungen zur Expression des HSP7O-Gens nach Hitzeschock und ohne Hitzeschock erfolgten sowohl auf der Ebene der RNA als auch auf der Protein-Ebene. Durch eine Northern-Blot-Analyse wurde eine erhöhte Transkripmenge der HSP70-mRNA in hitzeinduzierten Ciliaten festgestellt. Auf der Protein-Ebene zeigte sich jedoch kein quantitativer Unterschied zwischen hitzeinduzierten und nicht hitzeinduzierten Zellen. Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis: 1.ZUSAMMENFASSUNG1 2.EINLEITUNG2 2.1Die Genomorganisation des hypotrichen Ciliat Euplotes crassus2 2.2Konjugation und Makronukleusentwicklung bei Euplotes crassus4 2.3Transk:riptinelle Regulation der Genexpression5 2.4Transkriptionelle Regulation der Genexpression am Beispiel der Hitzeschockgene7 2.5Ziel der Arbeit8 3.MATERIAL9 3.